مایه زنی ویروس موزاییک خیار به توتون­های تراریخت و تیپ وحشی انجام شد و پس از دیدن علایم در گیاهان تیپ وحشی­ در سه زمان متفاوت شامل ۱۵، ۲۰ و ۳۰ روز بعد از مایه زنی ویروس موزاییک خیار از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی نمونه برداری انجام شد. بعد از دیدن علایم در گیاهان تیپ وحشی­ به مدت دو ماه روند شدت علایم را در گیاهان تراریخت­ مشاهده و ثبت شد.
۳-۴- آزمون الایزا برای ویروس موزاییک خیار

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

بعد از مشاهده­ علایم و برای اندازه ­گیری جذب نوری ویروس درگیاهان تیپ وحشی و تراریخت ۲ /۰ گرم از بافت برگی ­برداشت شد و در حاون عصاره­ گیری شد. سپس سانتریفیوژ به مدت ۳ دقیقه با دورxg 3000 انجام شد و ۵۰ میکرومول از عصاره و ۵۰ میکرومول از بافر PVP در پلیت الایزا ریخته و در دمای ۴ درجه سانتی گراد به مدت ۴ ساعت قرار داده شد. سپس سه مرتبه با بافرشستشو داده شد و آنتی بادی ویروس موزاییک خیار به آن اضافه شد و در در دمای ۳۷ درجه به مدت ۴ ساعت قرار داده. مجددا سه مرتبه با بافر شستشو داده شد و سپس آنتی ربیت اضافه شد و ۴ ساعت در دمای ۴ درجه قرار داده شد و با بافر شستشو داده شد در نهایت به آن سوبسترای آنزیم اضافه شد و جذب نوری ویروس در گیاهان تیپ وحشی و تراریخت با بهره گرفتن از دستگاه Elisa Reader تعین شد. و سپس داده ­ها با بهره گرفتن از نرم افزار MINITAB 17 در طرح کاملا تصادفی تجزیه و تحلیل شدند.
۳-۵- تایید تراریختی
۳-۵-۱- استخراج DNA ی ژنومی
به منظور حذف آلودگی ها تمام وسایل مورد نیاز برای استخراج DNA شامل ویال­ها و تیپ­های سمپلر و حاون های چینی اتوکلاو شدند.
استخراج DNA طبق دستورالعمل استاندارد روش Miniprepانجام شد (Gawel and Jarret 1991). در این روش از بافر CTABاستفاده شد (جدول ۳-۲).

1. 1. قبل از شروع کار بافر استخراج به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی ­گراد در حمام آب گرم قرار داده شد و یک میلی لیتر از بافر استخراج، ۱ میکرولیتر ۲-­ مرکاپتواتانول^[۲۳] اضافه شد.

1. 1. حدود ۱۰۰میلی گرم از بافت برگ توسط ازت مایع پودر شد و در داخل ویال قرار داده شد.

1. 1. به هر ویال ۷۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج که از قبل گرم شده، اضافه شد و تا زمانی که یک مخلوط یکنواخت ایجاد کند، به هم زده شد.

۴- ویال به مدت ۳۰ دقیقیه در دمای ۶۵ درجه سانتی ­گراد در حمام آب گرم قرار داده شد. پس از سرد شدن ۶۰۰ میکرولیتر کلروفرم- ایزوآمیل الکل به نسبت ۱:۲۴به آن اضافه و چندین بار تکان داده شد
۵- سپس با سرعت xg1200 به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ انجام شد.
۶- فاز رویی به یک ویال جدید انتقال یافت و ۵۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانول سرد به آن اضافه و محتویات ویال با هم مخلوط شد.
۷- این مخلوط با سرعت xg1200 به مدت ۸ دقیقه سانتریفیوژ شد و فاز رویی حذف شد و ویال بر روی دستمال کاغذی به مدت ۱۵ تا ۱۰ دقیقه قرار داده شد تا خشک شود.
۸- حدود ۳۰۰ میکرولیتر اتانول ۷۰ درصد به تیوب اضافه شد. سپس ضربه­های ملایم به پایین ویال وارد شد تا این عمل به شستشوی بهتر و حذف بقایای نمک کمک کند.
۹- سانتریفیوژ با سرعت xg 1200و به مدت ۸ دقیقه انجام شد.
۱۰- فاز رویی حذف و ویال به وسیله دستگاه کونسنتراتور^[۲۴] خشک شد.
۱۱- رسوب DNAدر ۶۰ ماکرولیتر آب اتوکلاو شده یا بافر TE ( PH=9/7) حل شد و به مدت یک ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گرفت تا DNAکاملا در بافر حل شود. توجه شود که اگر از بافت فریز شده استفاده می شود فقط از CTAB 2% استفاده شود.
جدول۳-۲- تهیه ی بافر استخراج DNA