ابتدا یک گرم از محیط DMEM را به ۸۰ میلی‌لیتر آب مقطر دوبار تقطیر استریل اضافه شد و ۳/۰ گرم بیکربنات سدیم به محیط اضافه شد تا سیستم بافری محیط تامین شود و از تغییر pH جلوگیری شود. سپس به آن یک میلی‌لیتر L-گلوتامین اضافه شد. آنتی‌بیوتیک به طور تجاری به صورت مخلوط ۱۰ هزار واحد پنی‌سیلین به همراهmL/µg100000 استرپتومایسین وجود داردکه به آن pen_strep گفته می‌شود، با برداشت یک میلی لیتر به ۱۰۰ میلی لیتر محیط کشت از این مخلوط آنتی‌بیوتیکی تهیه شده به محیط کشت اضافه شد که درنتیجه در محیط کشت مقدار ۲/۰ میلی مولار آنتی بیوتیک تامین شد. سپس با آب محیط را به حجم ۹۰ میلی لیتر رسانده شد و pH آن به روی ۲/۷-۴/۷ تنظیم شد و بشر مورد نظر را به زیر هود انتقال داد شد و در زیر هود ۱۰ میلی لیتر سرم گوساله تازه متولد شده اضافه شد و در این حالت حجم نهایی محیط به ۱۰۰ میلی لیتر رسید. در نهایت محیط کشت تهیه شده به کمک یک فیلتر سرنگی ۲۲/۰میکرون فیلتر و استریل شد. برای هر۵۰ میلی لیتر از محیط کشت نیاز به یک فیلتر سرنگی است. محیط بعد از فیلتر کردن، به کمک یک پیپتور به فلاسک انتقال داده شد و به مدت یک شبانه روز در انکوباتور ^ºc37 قرار داده شد و بعد از اطمینان از آلوده نبودن محیط وبررسی نبود کدورت در محیط کشت، سلول‌ها به فلاسک‌های حاوی محیط کشت جدید انتقال داده شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

تجدید کشت دودمان سلولی A549
سلول‌های چسبان تا رسیدن به مرحله تراکم کامل و پوشاندن کامل کف فلاسک یا اتمام مواد غذایی موجود در محیط کشت به صورت تک لایه تکثیر می‌یابند. وقتی کف فلاسک پر شد، سلول‌ها باید کشت مجدد داده شوند تا از مرگ آنها جلوگیری شود. برای کشت مجدد باید سلول‌ها را به حالت سوسپانسیون در آورد شود. میزان چسبندگی تیره‌های سلولی مختلف بایکدیگر متفاوت است. اما برای آزاد کردن اغلب سلول‌ها از کف فلاسک از پروتئازها بخصوص تریپسین استفاده می شود. تریپسین باعث شکستن و تخریب پروتئین‌های موثر در اتصال بستر می‌شود و EDTA موجب شلاته شدن و حذف کاتیون‌های دوظرفیتی به‌ خصوص کلسیم و منیزیم می‌شود. عملکرد تریپسین توسط پروتئین‌های سرم که در حقیقت یکی از سوبستراهای تریپسین هستند متوقف می‌شود. به علاوه سرم ممکن است حاوی مواد آنتی پروتئاز نیز باشد (۱).
برای تجدید کشت دودمان سلولی A549 ابتدا فلاسک حاوی سلول‌ها به کمک میکروسکوپ فاز معکوس از نظر میزان تراکم و عدم آلودگی باکتریایی و یا قارچی بررسی شد و سپس محیط رویی سلول ها به طور کامل تخلیه شد. لایه سلولی را با بافر فسفات (PBS)^[69]که با EDTA مخلوط بود و به دمای محیط رسانده شده بود، شستسو داده شد و سپس تخلیه شد. این امر به علت چسبندگی بالای این دودمان سلولی است.
برای آزاد سازی سلول‌ها از محلول ۲۵/۰%(w/v)ترپسین -۵۳/۰%میلی مولار EDTA استفاده شد تا اثر کامل سرم را که باعث مهار اثر تریپسین می شود را مهار کند. سپس به فلاسک ۲-۳ میلی لیتراز محلول تریپسین –EDTA اضافه شد و بعد از حدود۵-۱۵دقیقه محلول اثر خود را گذاشته و سلول‌ها آزاد شدند. برای بهتر انجام شدن فرایند فلاسک در دمای^ºc37در انکوباتور قرار داده شد. بعد از بررسی سلول‌ها در زیر میکروسکوپ فاز معکوس و اطمینان از آزاد شدن سلول‌ها، به محلول داخل فلاسک ۶-۸ میلی لیتر از محیط کشت تازه اضافه شد تا اثر تریپسین را خنثی کند و در ادامه سلول‌ها به آرامی پیپت شدند.
سپس سوسپانسیون سلولی به دو قسمت مناسب تقسیم و به محیط کشت جدید انتقال داده شد، در طی این مراحل این نکته در نظر گرفته شد که سلول‌ها باید بین ۱۰^۳*۲ و یا ۱۰^۴*۱ Cell/Cm² سلول باشند تا توانایی و قابلت زیست داشته باشند و نباید تراکم سلولی بیش ازCell/Cm² ۱۰^۴*۷ باشد. برای اطمینان از این امر مقدار ۱۰۰-۲۰۰ میکرو لیتر از سوسپانسیون سلولی را برداشته شد و شمارش سلولی انجام شد تا تعداد سلول ها در هر میلی متر محیط کشت بدست آید (۱)، (۱۴).
شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول
برای انجام اغلب فرایندهای کشت سلولی نظیرانجماد، تجدید کشت، دگرگون کردن و ادغام سلولی، دانستن تعداد سلول‌ها ضروری است. استفاده از تعداد سلول مناسب و ثابت باعث بهبود رشد سلول‌ها شده و به استاندارد شدن فرایند کشت سلولی کمک می‌کند. استاندارد شدن فرایندها باعث تکرارپذیری بهتر و تولید محصولات با کیفیت‌تر می‌شود.
برای شمارش از لام نئوبار استفاده شد. قبل از ریختن سلول‌ها در اتاقک لام سوسپانسیون سلولی چند بار به کمک سمپلر همگن شد تا از تشکیل توده‌ سلولی و رسوب‌های سلول جلوگیری شده و دقت کار افزایش یابد. نکته قابل توجه این است که، هنگام پرکردن اتاقک شمارش، سلول‌ها بطور تصادفی در اتاقک مذکور پخش می‌شوند، لذا هر چه تعداد سلول‌های شمرده شده بیشتر باشد دقت و صحت شمارش بیشتر خواهد بود.
برای رقیق کردن سلول‌ها در هنگام شمارش از محلول تریپان بلو ۴/۰% استفاده شد. تریپان بلو یک رنگ حیاتی است، لذا غشاء سلول‌های زنده اجازه عبور به آن نمی‌دهند و در صورت ورود آن را از خود دفع می کنند. اما غشاء سلول‌های مرده توان خارج کردن رنگ حیاتی از سیتوپلاسم را ندارد، لذا سلول‌های مرده آبی رنگ می‌شوند و از سلول‌های زنده که رنگ نمی‌گیرند به راحتی قابل تشخیص هستند (۱).
ابتدا به کمک تریپسین –EDTA سلول‌ها آزاد شده و در حجم کمی از محیط کشت به حالت سوسپانسیون در آورده شد و تحت شرایط استریل ۱۰۰ میکرو لیتر سوسپانسیون سلولی برداشته شد و هم حجم آن تریپان بلو ۴/۰ درصد اضافه شد و با پیپت چند بار پیپت شد و با این کار سلول‌ها دوبار رقیق شدند. روییک لام نئوبار تمیز یک لامل قرار داده شد و سپس از سوسپانسیون سلولی آغشته به رنگ ۱۰-۱۲میکرو لیتر به روی لام نئو بارریخته شد. پس از چند لحظه سلول‌ها در کف لام ته‌نشین و ثابت شد و سپس با میکروسکوپ نوری و با بزرگ نمایی۲۰۰برابر بررسی شدند. تعداد سلول‌های موجود در یک مربع ۱۶ خانه‌ای شمارش شد و در ضریب رقت و عدد ۱۰۰۰۰ ضرب شد عدد حاصل نشان دهنده‌ی تعداد سلول‌ها در یک میلی‌لیتر حجم محیط کشت است که برای بدست آوردن تعداد کل سلول‌ها عدد مذکور در حجم سوسپانسیون ضرب شد. سلول‌های زنده در این تست شفاف هستند و سلول‌های مرده به رنگ بنفش دیده می‌شوند.
تهیه محلول تریپسین
۲۵/۰ گرم از پودر تریپسین به علاوه ۰۲/۰گرم پودر EDTA به آرامی به ۱۰۰ میلی لیتر PBS یک مولار اضافه شد و روی همزن مغناطیسی قرارداده شد تا خوب حل شود. بعد از این که به خوبی حل شد محلول فوق با فیلتر ۲۲/۰ میکرون استریل شد. سپس به آن آنتی‌بیوتیک پنی سیلین به مقدار ۱۰۰ واحد بین المللی در هر میلی لیتر و استرپتومایسین به میزان ۱۰۰میکرو گرم در میلی لیتر اضافه شد. این محلول در فالکون‌های ۵۰ میلی لیتری تقسیم شد و جهت مصارف کوتاه مدت در یخچال و برای نگهداری طولانی‌تر در فریزر ۲۰- قرار داده شد.
آزمون MTT^[70]
فعالیت و سرعت تکثیر سلول‌ها ممکن است تحت تاثیر هورمون‌ها، فاکتور‌‌های رشد، سیتوکاین‌ها و میتوژن‌ها افزایش یافته یا تغییری نکند. همچنین بعضی از داروها و عوامل سیتوتوکسیک نظیر داروهای ضد سرطان ممکن است باعث نکروز یا آپپتوز سلول‌ها شده و موجب کاهش سرعت تکثیر یا رشد سلول‌ها شود.
در سال ۱۹۸۳ آزمایش MTT به عنوان جایگزینی برای روش‌های قبلی مانند استفاده از لام نئوبار و رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو ویا روش‌های رادیواکتیو پیشنهاد شد. دراین روش آنزیماتیک بعنوان سوبسترای واکنش از نمک‌های محلول تترازولیوم که معمول‌ترین آنها MTT است استفاده می‌شود. این روش نسبت به سایر روش‌های بررسی تکثر سلولی ساده‌تر بوده است. بعلاوه کلیه مراحل آزمایش در پلیت‌های ۹۶ و یا ۴۸ خانه کشت سلولی انجام شده و نتایج با دستگاه الایزا ریدر قرائت می‌شود لذا تعداد زیادی نمونه را می‌توان همزمان آزمایش کرد.
آزمایش MTT یک روش رنگ سنجی است که براساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال‌های زرد رنگ تترازولیوم بوسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل کریستال‌‌های آبی رنگ نامحلول انجام می‌شود. در این روش، برخلاف سایر روش‌ها، مراحل شستشو و جمع آوری سلول که اغلب باعث از دست رفتن تعدادی از سلول‌ها و افزایش خطای کار می‌شوند، حذف شده‌اند و تمام مراحل آزمایش از ابتدای کشت سلولی تا قرائت نتایج با فتومتر،در یک میکروپلیت انجام می‌شوند لذا تکرار پذیری، دقت و حساسیت آزمایش بالاست (۱).
شمارش سلول برای انجام آزمونMTT
آزاد سازی سلول‌ها به روشی که در بخش‏۳-۱۳-۱-۱-۲- شرح داده شد انجام شد. سپس روی یک لام نئوبار تمیز یک لامل قرار داده شد و۱۰ میکرولیتر ازسوسپانسیون سلولی در شرایط استریل برداشته شد و به اتاقک لام نئوبار اضافه شد. برای افزایش دقت کار سلول‌های موجود در سه مربع ۱۶ خانه‌ای شمارش شد و اعداد آن‌ها با هم جمع و میانگین گرفته شد و در ۱۰۰۰۰ضرب شد و عدد بدست آمده بر ۱۰۰۰ تقسیم شد تا عدد حاصل نشان دهنده‌ی تعداد سلول‌ها در یک میلی‌لیتر حجم محیط کشت باشد (با کمی تغییرات ۱).
روش انجام آزمون MTT دراین پژوهش
ارزیابی MTT برای تعیین تاثیر سمیت سلولی عصاره‌های جدایه‌ها استفاده شد و طراحی تست بر اساس Xie وهمکاران (۶۲) انجام شد. در ابتدا ازDMSO برای حل کردن عصاره‌ها استفاده شد که ذخیره‌هایی حاوی ۰۰۴/۰ گرم در یک میلی لیترDMSO تهیه شد. A549 در گروه سلول‌های چسبنده قرار دارد. برای انجام تست سلول‌ها همان‌طور که قبلا در مرحله‌ی کشت مجدد سلولی (‏۳-۱۳-۱-۱-۲-) توضیح داده شد، از کف پلیت جدا شدند و برای هر چاهک تعداد ۱۰^۴*۴Cell/Well در نظر گرفته شد که از سوسپانسیون سلولی مقدار ۲۱ میکرو لیتر کشیده شد تا تعداد لازم تامین گردد و به چاهک‌های پلیت ۴۸ خانه اضافه شد. بعد از ۲۴ ساعت واطمینان از چسبیدن سلول‌ها به کف پلیت، مقدارlμ ۵/۲ از ذخیره کاری عصاره به هر چاهک اضافه شد تا غلظت g/mlµ۵ در هر چاهک تامین شود. انتخاب این غلظت براساس پائین‌ترین غلظت در تست سمیت سنجی‌‌آرتمیا (تست غربالگری اولیه) انتخاب شده است. سلول‌هایی که در معرض غلظت مساوی از DMSO بدون حضور عصاره‌ها تیمار شده بودند، همچنین سلول‌هایی هم تنها به همراه محیط کشت تیمار شدند، که این دو گروه به عنوان شاهد در نظر گرفته شدند و برای هر عصاره سه تکرار انجام شد. پس از انکوباسیون به مدت ۴۸ ساعت، به هر چاهک ۵۰ میکرولیتر از محلول ۱۰x، MTT به چاهک‌ها اضافه می‌کنیم و به مدت سه ساعت در انکوباتور^Cº۳۷ قرار داده شد، پس از پایان این مدت محلول رویی که حاوی محیط کشت سلول به همراه نمک MTT دور ریخته شد و به هر چاهک۱۰۰میکرولیتر DMSO اضافه شد. بعد از اضافه کردنDMSO به همه‌ی چاهک‌ها،۱۰۰ میکرو لیتر از محتویات هر چاهک به پلیت‌های ۹۶ خانه الایزا منتقل و پلیت در دستگاه الایزا قرار داده شد و میزان جذب در طول موج ۵۷۰ نانومتر توسط الایزا ریدر اندازگیری شد. نتایج حاصل از تست به کمک نرم افزارSPSS 19 و با استفاده ازIndependent Sample T test آنالیز داده‌ها انجام شد. در این تست هر نمونه با شاهد منفی (سلول به همراه محیط کشت) مقایسه شد و۰۵/۰ p≤ در نظر گرفته شد. همچنین میانگین هر چاهک تیمار شده با عصاره نیز نسبت به شاهد به کمک نرم افزار Excel رسم شد.
بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها
پس از تیمار سلول‌ها به مدت ۴۸ ساعت با عصاره‌ها مطابق روش بخش‏۳-۱۶- قبل از انجام آزمون MTT سلول‌ها در زیر میکروسکوپ فاز معکوس مورد بررسی قرار گرفت. برای هر نمونه عصاره سه تکرار انجام شد که هر سه این چاهک‌ها در زیر میکروسکوپ بررسی شد. هر چاهک با شاهد که سلول به همراه محیط کشت آن بود مقایسه شد وچاهک هایی که در آن‌ها بین ۰-۲۵ درصد سلول‌ها مرفولوژی طبیعی خود را از دست داده بودند را امتیاز+(شکلA)، چاهک‌هایی که بین ۲۵-۵۰ درصد از سلول‌ها مرفولوژی طبیعی آن‌ها از بین رفته بود امتیاز ++ (شکل B) وچاهک‌هایی که بین ۵۰-۷۵ درصد سلول‌ها آسیب دیده بودند امتیاز +++(شکلC) و چاهک‌هایی که ۷۵-۱۰۰ درصد سلول ‌ها آسیب دیده و مرفولوژی حیاتی خود را از دست داده بودن را امتیاز ++++(شکل D) داده شد (شکل ‏۳‑۱)، (۱۲)، (۶۰) ،(۲۷).
شکل ‏۳‑۱: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب بین ۰- ۲۵%(A)، میزان آسیب بین ۲۵-۵۰% (شکلB)،میزان آسیب بین۵۰-۷۵%(شکل C)،میزان آسیب بین ۷۵-۱۰۰% (شکل D) می‌باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی آورده شده است
شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست
بررسی مورفولوژی میکروسکوپی
بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری
برای مشاهده شکل دست نخورده میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری از روش لام مایل استفاده شد(۳۴).
محیط ISP2 مانند بخش‏۳-۴- تهیه شد و پس از استریل کردن در پلیت ریخته شد و قبل از بسته شدن کامل آگار لامل‌های استریل به صورت مورب در محیط فرو برده شد. پس از بسته شدن آگار در مرز بین محیط کشت و لامل، به وسیله‌ فیلدوپلاتین مقدار کمی باکتری قرار داده شد. پلیت‌ها به مدت ۱۴ روز در دمای^OC28 گرماگذاری شد. بعد از طی این مدت لامل‌ها به آهستگی از محیط بیرون کشیده شد و پس از رنگ‌آمیزی با کریستال ویوله به مدت ۲ دقیقه با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی رشد میسلیومی در محیط ISP2 broth
محیط ISP2 broth مانند بخش ‏۳-۵- تهیه شد و بعد از استریل کردن به کمک فیلدوپلاتین مقداری اسپور باکتری به درون محیط تلقیح شد و در دمای ^oC28 در شیکر با دورrpm 200 به‌مدت ۴۸ ساعت گرماگذاری شد. پس از طی شدن این مدت یک نمونه لام از محیط تهیه شد و رنگ‌آمیزی لام با کریستال ویوله به مدت ۲ دقیقه انجام شد و نمونه‌ها با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت.
مطالعه شیمیوتاکسونومی
تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)
یک لوپ حاوی اسپور سویه­‌های انتخاب شده درml20 محیط ISP2 broth تهیه شده در بخش ‏۳-۵- کشت داده شد و فلاسک‌ها به مدت ۷-۵ روز در دمای در^OC28 دور rpm220 برای فراهم سازی زیست توده گرما گذاری شدند. پس از طی مدت زمان تعیین شده، از هر کدام از فلاسک‌ها لام میکروسکوپی تهیه شد و به وسیله رنگ آمیزی گرم و با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری از عدم وجود آلودگی در محیط کشت اطمینان حاصل شد. سپس مایع کشت حاصل را داخل یک فالکون ml50 ریخت شد و در دورrpm4000 به مدت ۱۵ دقیقه برای جداسازی زیست توده از مایع‌رویی سانتریفیوژ شد.
مایع‌رویی را داخل یک بشر ریخته و سپس اتوکلاو شد. زیست‌توده حاصل با حجم مساوی از آب مقطراستریل شستشو داده شد. زیست‌توده به دست آمده داخل یک فویل آلومینیومی ریخته شد و درفور^OC80 به مدت ۱۸ساعت، زیست‌توده خشک به دست آمد.
تعیین ایزومر DAPموجود در دیواره سلولی
۳ میلی گرم از زیست‌توده خشک به دست آمده به داخل لوله‌های آزمایش درپیچ‌دارپیرکس انتقال داده شد. ml3 از HCl 6نرمال به بیومس موجود در لوله‌ها افزوده شد و دردمای^OC100به مدت ۱۸ ساعت داخل فور قرار داده شد. پس از خنک شدن لوله‌های آزمایش هیدرولیزشده سلولی به دست آمده با کمک کاغذصافی از بقایای جامد جدا شد و سپس به شیشه پنی‌سیلین های حاوی هیدرولیزشده سلولی صاف شده ml3 آب مقطر اضافه شد. بخش صاف شده حاصل درحمام آبجوش قرارداده شد تا به طور کامل خشک شود. باقیمانده حاصل درμl30 آب مقطرحل شد. سپس حدود یک میکرولیتر از محلول بدست آمده با کمک لوله مویین بر روی صفحه TLC قرار داده شد. فرایند تفکیک به کمک سیستم حلالی متانول- آب مقطر- هیدروکلریک اسید۶ نرمال- پیریدین با نسبت حجمی (۸۰:۲۶:۴:۱۰) پس از اشباع شدن تانک از حلال‌ها به مدت دو ساعت انجام گرفت. پس از گذشت ۳ ساعت پلیت از تانک خارج شد و در معرض هوا خشک شد. برای مشاهده لکه‌ها پلیت با محلول ۱/۰% نین‌هیدرین در استون اسپری شد. پس از خشک شدن در معرض هوا پلیت به مدت ۲ الی ۳ دقیقه در دمای ^OC 100 قرار داده شد. سایر اسیدهای آمینه به رنگ بنفش یا ارغوانی ظاهر شذه و جلوتر از دی آمینوپی ملیک اسید حرکت می‌کنند. مولکول های DAP در قسمت پایینی صفحه و به رنگ زرد مایل به سبز نمایان می‌شوند. ایزوفرم L دارای R_f کمتری نسبت به نوع meso بوده. نوع ایزومر دی آمینوپی ملیک اسید موجود در دیواره سلولی سویه‌ها باتوجه به سویه‌های استاندارد مشخص گردید (۱۷).
شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن ۱۶S rRNA سویه‌های منتخب
تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)
برای تهیه زیست‌توده سویه‌های منتخب، این سویه‌ها در محیط LB کشت داده شد. این محیط حاوی ترکیباتی است که در جدول ۳-۷ آورده شده است. مقدارهای آورده شده برای تهیه ۱۰ میلی‌لیتر محیط کشت می‌باشد. این محیط‌ها در فلاسک های ۱۰۰ میلی لیتری ارلن مایر تهیه شد، ۳/۷ pH تنظیم شد و در^OC121 به مدت ۱۵ دقیقه استریل شد (۱۹).
جدول ‏۳‑۷:ترکیبات محیط کشت LB(19)