NM_009810/3
۱۳۸
AAAGACCATACATGGGAGCA
CGAGATGACATTCCAGTGCT
Caspase-3-F
Caspase-3-R
NM_001127233/1
۲۰۳
AACTTACCAGGGCAACTATG
TGTGCTGTGACTTCTTGTAG
TP53-F
TP53-R
NM_001289726
۱۲۵
GACTTCAACAGCAACTCCCAC
TCCACCACCCTGTTGCTGTA
GAPDH-F
GAPDH-F
جدول۲-۲-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده
۲-۸-۶-۲-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها
جهت اطمینان از صحیح بودن محل اتصال پرایمرها و بهینه کردن واکنش ها، ابتدا مراحل real-time PCR با بهره گرفتن از cDNA ساخته شده از RNA مستخرج از بیضه موش نابالغ انجام شد. در این مرحله پس از هر واکنشPCR ، محصول به دست آمده بر روی ژل الکتروفورز مورد ارزیابی قرار گرفت تا طول باندهای تشکیل شده، اتصال پرایمر به ژن مورد نظر را تأیید کند.
۲-۸-۷-الکتروفورز
۲-۸-۷-۱-روش ساخت بافر۵۰X TAE
ساخت این بافر در سه مرحله انجام می شود که دو مرحله ی اول آن برای ساخت EDTA است.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
مرحله ی اول: ابتدا ۶/۹۳ گرم از EDTA به ۵۰۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر اضافه شده و با اضافه کردن ۱۵-۲۰ قرص NAOH به این محلول کدر، محلول شفافی حاصل می گردد.
مرحله ی دوم: در این مرحله، ۲۴۲ گرم Trizma base به ۵۰۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر اضافه شده و برای حل شدن کامل بر روی شیکر قرار می گیرد.
مرحله ی سوم: در این مرحله ۱۰۰ میلی لیتر EDTA با ۵۷ میلی لیتر اسید استیک مخلوط شد و به محلول حاصله در مرحله ی دوم اضافه گردید، حجم داخل ظرف با آب دوبار تقطیر به حجم ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
۲-۸-۷-۲-روش ساخت بافر X TAE1
جهت ساخت ۱x TAE Buffer، ۲۰ میلی لیتر بافر ۵۰X TAE را با ۹۸۰ میلی لیتر آب مقطر ترکیب کرده و از این بافر برای تهیه ی ژل آگارز و همچنین برای پر کردن تانک الکتروفورز استفاده شد.
۲-۸-۷-۳-طرز تهیه ی ژل آگارز
ژل مورد استفاده برای بررسی کیفی RNAو همچنین بررسی اختصاصی بودن پرایمرها، با غلظت ۷/۱ درصد و با بهره گرفتن از محلول بافر X TAE1 تهیه شد. برای کمک به حل شدن آگارز، محلول به مدت ۱ دقیقه در داخل دستگاه ماکروویو قرار داده شد و پس از خارج کردن ژل از ماکروویو در صورت شفاف بودن محلول، به ازای هر ۱۰۰ میلی لیتر محلول، ۷ میکرولیتر رنگGel Red[69] به محلول اضافه گردید.
۲-۸-۷-۴-بررسی آلودگی پرایمر
۸ میکرولیتر پرایمرForward و ۸ میکرولیتر پرایمر Reverse به صورت جداگانه با ۲ میکرولیتر Loading Die ترکیب شدند و مخلوط حاصل در چاهک های ژل قرار داده شدند. در نهایت پس از افزودن DNA Ladder bp50 به یکی از چاهک ها، تانک الکتروفورز به منبع تغذیه وصل شد و به مدت ۴۵ دقیقه با ولتاژ ۸۵ ران شد، سپس ژل از تانک الکتروفورز بیرون آورده شد و داخل دستگاه Gel documentation قرار گرفت. وجود یک تک باند واضح در موقعیت مناسب نسبت به Ladder بر روی ژل نشان دهنده عدم وجود آلودگی است.
۲-۸-۷-۴-بررسی کیفیت RNA
غلظت ۱۰۰۰ نانوگرم در میکرولیتر از RNA با ۲ میکرولیتر رنگ ترکیب شد و مخلوط حاصل در چاهک قرار گرفت و ژل با ولتاژ ۸۵ ران شد، وجود ۳ باند s 18 ،s 28 و s5 نشان دهنده ی بالا بودن کیفیت RNA و وجود اسمیر و عدم وجود باند نشان دهنده ی تخریب RNA است.
۲-۸-۸-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر
محلول حاوی مواد زیر تهیه شد.
cDNA 1 µl
Reverse Primer 1 µl
Forward Primer 1 µl
Master 12 µl
