۳-۹-۷- تزریق گلبول قرمز گوسفند و خونگیری جهت تعیین پاسخ سیستم ایمنی
در روزهای ۲۱ و ۳۵ به دو قطعه پرنده از هر پن مقدار ۱/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون گلبول قرمز گوسفند ۵/۰ درصد شسته شده در بافر فسفات استریل، از طریق عضله سینه تزریق گردید. ۶ روز پس از هر بار تزریق گلبول قرمز (روزهای ۲۷ و ۴۱)، از همان پرندهها از طریق ورید بال حدود یک میلی لیتر خون گرفته شد. نمونه های خون یک شب در دمای اتاق نگهداری شدند تا سرم از لخته خون جدا شود. سرم بدست آمده با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفوژ گردید. سرم بلافاصله در دمای ۴ درجه‌ سانتیگراد قرار داده شد.
۳-۹-۸- خونگیری جهت تعیین کلسترول، تریگلیسیرید و HDL سرم
در روز ۴۲ پرورش جوجههای گوشتی از هر واحد آزمایشی یک قطعه پرنده انتخاب شده و از آنها جهت اندازه گیری کلسترل سرم از طریق ورید بال، خونگیری به عمل آمد. نمونه های خون پس از مدتی که در دمای اتاق برای جداشدن سرم از لخته نگهداری شد، برای اندازه گیری کلسترول سرم به آزمایشگاه انتقال یافت.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۹-۹- تهیه جیرههای حاوی مارکر به منظور تعیین قابلیت هضم ایلئومی
جهت تعیین قابلیت هضم ظاهری مواد مغذی با بهره گرفتن از جیره حاوی مارکر، اکسید کروم (Cr₂O₃) به عنوان مارکر در جیرههای آغازین و رشد استفاده شد. ابتدا یک دوره سه روزه به منظور عادت دهی جوجهها به این جیرهها، قبل از جمع آوری مدفوع در روزهای ۱۸، ۱۹ و ۲۰ برای دوره آغازین و ۳۹، ۴۰ و ۴۱ برای دوره رشد در نظر گرفته شد. اکسید کروم به میزان ۳ گرم در هرکیلوگرم دان(۳/۰ درصد) با جیره مخلوط گردید و سپس در اختیار جوجهها قرار گرفت.
۳-۹-۱۰- جمع آوری نمونه مدفوع جهت تعیین قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی
پس از سه روز که جیره حاوی مارکر در اختیار جوجهها قرار گرفت، از هر واحد آزمایشی یک پرنده کشتار شده و مدفوع درون ایلئوم آنها از محل فاصله کیسه زرده (مکل) تا انتهای ایلئوم (۲ سانتیمتر مانده به تقاطع ایلئوم- سکوم) جمع آوری گشته و درون قوطیهای پلاستیکی شمارهدار قرار داده شدند، و تا زمان انجام آزمایشات هضمی در دمای ۲۰- درجه سلسیوس قرار گرفتند (هانگ و همکاران، ۲۰۰۵).
۳-۱۰- متغییرهای اندازه گیری شده در آزمایشگاه
۳-۱۰-۱- اندازه گیری کلسترول سرم
در سن ۴۲ روزگی از هر واحد آزمایشی یک پرنده انتخاب و از طریق سر بریدن حدود ۲ میلی لیتر خون گرفته شد. پس از انعقاد خون، نمونه های سرم جدا شده و به میکروتیوپ منتقل شده و برای اطمینان از عدم باقی ماندن لخته در سرم سانتریفیوژ در دور ۴۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه انجام و سپس سرم شفاف به لوله دیگری منتقل گردید. کلسترول موجود در نمونه های سرم با بهره گرفتن از روش آنزیمی CHOD-PAP و با کیت تجاری^[۱۱۰]تعیین شد (ریچ موند، ۱۹۷۳).
۳-۱۰-۲- اندازه گیری تریگلیسیرید
تریگلیسیرید موجود در نمونه های سرم با بهره گرفتن از روش آنزیمی GPO/Trinder و با کیت تجاری^[۱۱۱]تعیین شد (ریچ موند، ۱۹۷۳).
۳-۱۰-۳- اندازه گیری کلسترول-HDL
HDL- کلسترول موجود در نمونه های سرم با بهره گرفتن از روش آنزیمیCHOD-PAP و با کیت تجاری^[۱۱۲]تعیین شد (ریچ موند، ۱۹۷۳).
۳-۱۰-۴- تعیین عیار پادتن تولید شده علیه گلبول قرمز گوسفند
برای تعیین عیار آنتی بادی تولید شده علیه گلبول قرمز گوسفند از روش هماگلوتیناسیون میکروتیتر استفاده شد (وگمان و اسمیت، ۱۹۶۶؛ پترسون و همکاران، ۱۹۹۹). به این منظور نمونه های سرم جهت خنثی شدن سیستم کمپلمان و عدم تداخل آن با آنتی بادی ضد گلبول قرمز گوسفند به مدت سی دقیقه در دمای ۵۵ درجه‌ سانتیگراد در گرم خانه گذاشته شد. به کلیه‌ چاهک های میکروپلیت U شکل، مقدار ۲۵ میکرولیتر محلول بافر فسفات افزوده شد. سپس از هر نمونه سرم مقدار ۲۵ میکرولیتر به اولین چاهک هر یک از ردیف های هشت گانه میکروپلیت افزوده شد و با بهره گرفتن از میکروپیپت سری رقت با عامل رقت ۵/۰ تهیه گردید. بدین ترتیب که پس از چند بار مخلوط کردن سرم و بافر در اولین چاهک هر ردیف، مقدار ۲۵ میکرولیتر از مخلوط به چاهک بعدی منتقل و این عمل تا آخرین چاهک ادامه یافت. از آخرین چاهک نیز ۲۵ میکرولیتر از مخلوط بیرون ریخته شد تا کلیه‌ چاهک ها ۲۵ میکرولیتر مخلوط سرم و بافر داشته باشند. در میکروپلیت یک ردیف بعنوان شاهد در نظر گرفته شد و به آن سرم اضافه نشد.

در مرحله آخر به هر یک از چاهک ها ۲۵ میکرولیتر سوسپانسیون ۱ درصد گلبول قرمز گوسفند در PBS به عنوان آنتی ژن افزوده شد و پلیت ها به مدت یک ساعت در دمای ۳۷ درجه ‌سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. پس از سپری شدن این مدت لگاریتم در مبنای ۲ عکس آخرین رقتی که در آن هماگلوتیناسیون دیده می شد به عنوان عیار آنتی بادی ثبت گردید.

۳-۱۰-۵- تجزیه شیمیایی نمونه ها
۳-۱۰-۶- ماده خشک
جهت تعیین ماده خشک نمونه ها، ۲۰ گرم از نمونه ها درون ظروف شیشهای از پیش وزن شده قرار داده شد و سپس به مدت ۱۶ ساعت درون آون ( خشک کن) با درجه حرارت ۱۰۵ درجه سلسیوس قرار گرفت. پس از آن که نمونه ها به وزن ثابت رسیدند،‌ در دسیکاتور خنک شده و پس از توزین،‌ از روی کاهش وزن نمونه ها نسبت به وزن اولیه بر حسب درصد، ماده خشک به صورت زیر محاسبه شد (آنونیموس، ۱۹۹۷).
   = درصد رطوبت
= a وزن ظرف خالی (گرم)
= b وزن نمونه خوراک قبل از قرار دادن در آون (گرم)
= c وزن نمونه خشک (گرم)
درصد رطوبت - ۱۰۰ = درصد ماده خشک
۳-۱۰-۷- انرژی خام
برای اندازه گیری انرژی خام از بمب کالریمتر استفاده شد. روش کار دستگاه : حرارت حاصل از سوختن ۱ گرم نمونه غذایی (یا نمونه دفعی) در محفظه دستگاه به آب منتقل میشود و از روی اختلاف درجه حرارت آب، (که ناشی از سوختن ماده مذکور بود) انرژی نمونه غذایی (و یا دفعی) اندازه گیری شد. هر یک درجه افزایش حرارت معادل ۰۲۸/۶۶۳۱ کیلو کالری انرژی است (آنونیموس، ۱۹۹۷)
۳-۱۰-۸- پروتئین خام
مقدار ۳/۰ گرم از هر نمونه به وسیله ترازو ( با دقت ۳ رقم اعشار) وزن شده و به لولههای مخصوص هضم منتقل گردید، به هر لوله ۵/۲ میلی لیتر از مخلوط اسیدها ( محلول شماره ۲) اضافه و با احتیاط تکان داده شد تا تمام ذرات خیس گردد. لولهها یک شب به حال خود رها شد و روز بعد ابتدا لولهها به بلوک هضم منتقل گردید و به مدت ۲ ساعت در حرارت ۱۰۰ درجه سلسیوس قرار گرفت. بعد از گذشت این مدت لولهها از بلوک هضم خارج گردید و بعد از سرد شدن لولهها، آب اکسیژنه به مقدار ۳ میلی لیتر به نمونه ها اضافه شد. به علت واکنش شدید آب اکسیژنه و محلول هضم شده لازم است که آب اکسیژنه را در سه مرحله ( هر مرحله ۱ میلی لیتر) درون لولهها بریزیم. لولهها را به بلوک هضم انتقال میدهیم و تا ۳۳۰ درجه سلسیوس حرارت میدهیم تا عصاره بی رنگ یا زرد کم رنگ گردد ( این مرحله معمولاً ۴-۳ ساعت طول میکشد). پس از آن لولهها از اجاق هضم خارج شده و بعد از خنک شدن به هریک از آنها در حدود ۳/۴۸ میلی لیتر آب مقطر اضافه گردید و محلول یک شب دیگر به حال خود گذاشته شد. برای تعیین درصد نیتروژن از دستگاه کجلدال استفاده شد حاصل ضرب عدد به دست آمده در ضریب ۲۵/۶،‌ نشان دهنده درصد پروتئین خام در نمونه های آزمایشی است (آنونیموس، ۱۹۹۷). روش ساخت محلول ذکر شده به صورت زیر است:
محلول شماره ۱: ۳۵/۰ گرم سلنیوم را به cc100 اسید سولفوریک اضافه کرده و به مدت ۴-۳ ساعت در حرارت ۳۰۰ درجه سلسیوس حرارت داده تا به رنگ زرد کم رنگ تبدیل شود.
محلول شماره ۲ :۲/۷ گرم اسید سالیسیلیک را در ۱۰۰ میلی لیتر محلول شماره ۱ حل میشود. این محلول را تا ۴۸ ساعت میتوان نگهداری نمود.
۳-۱۰-۹- اندازه گیری اکسید کروم در نمونه خوراک و مدفوع
در این آزمایش، اکسید کروم سه ظرفیتی (Cr₂O₃) به میزان ۳/۰ درصد به خوراک اضافه گردید. از آنجائیکه اکسید کروم از طریق دستگاه گوارش جذب نمیشود، غلظتش در مدفوع نسبت به غذا افزایش می یابد، که از این ویژگی برای اندازه گیری قابلیت هضم خوراک استفاده میشود. نمونه جهت حذف تمام مواد آلی، به خاکستر تبدیل میشود. در حضور مخلوط هضمی، اکسید کروم به کروم بدون آب محلول (اکسید کرومیک) تبدیل شده، که به آسانی پلیمریزه میشود. جذب نوری محلول در ۴۴۰ نانومتر اندازه گیری میشود.
۳-۱۰-۹-۱- وسایل لازم
۱- اسپکتروفتومترPye-unicam ، SP5-350

1. 1. صفح داغ با قابلیت کنترل درجه حرارت (هیتر)

1. 1. کوره

1. 1. بشر پیرکس

1. 1. توزیع کننده اسید، پیپت ۱۰-۵ میلی لیتر Brink man

1. 1. ترازوی آنالیتیک

۳-۱۰-۹-۲- مواد شیمیایی لازم
مخلوط هضمی: ۱۰ گرم از مولیبدات سدیم آبدار (Na₂Mo₄2H₂O) در ۵۰۰ میلی لیتر مخلوط اسیدی محتوی:

1. 1. ۱۵۰ میلیی لیتر اسید سولفوریک غلیظ

1. 1. ۲۰۰ میلی لیتر اسید پرکلریک ۷۰ درصد

1. 1. ۱۵۰ میلی لیتر آب مقطر