g240/0
Gentamicine 80 EXIR
cc1
۱-ریختن ml1000 آب مقطر درون ارلن ml800 و ارلن ml 200.
۲-اضافه و حل کردن کلسیم لاکتات درون ارلن ml200.
۳-اضافه و حل کردن Ham’s f10 و سدیم بی کربنات درون ارلن ml800.
۴- اضافه کردن کم کم محتوای ارلن که حاوی ml200 آب مقطر وکلسیم لاکتات بود را درون ارلن حاوی ml800 آب مقطر و Ham’s f10 و سدیم بی کربنات .
۵- افزودن جنتامایسین به محلول.
۶- سنجیدن اسمولاریته توسط دستگاه اسمولاریته متر ، اسمولاریته ی محلول باید Osmol/L10±۲۷۵ باشد.
۷- سنجش PH، PH باید ۵/۷ باشد.
۸- فیلتر کردن محیط به دست آمده با فیلتر میلی پور mμ۲۲/۰ بداخل ظروف استریل و نگهداری در یخچال تا موقع مصرف . (حداکثر مدت نگهداری در یخچال یک ماه)
۲-۲-۲- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)[69]
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
محلول HCl 08/0 نرمال (۶۶۰ میکرو لیتر HCI در ۳۴۰/۹۹ سی سی آب مقطر)
محلول لیز کننده یک شامل مرکاپتواتانول۸/۰مولار، تریس۴/۰مولار، SDS1% و EDTA 50 میلی مولار می باشد.
محلول لیز کننده دو شامل NaCl 2مولار، تریس۴/۰مولار و SDS1% می باشد.
محلول Trisborate- EDTA شامل اسیدبوریک۰۹/۰مولار، تریس۰۹/۰مولار و EDTA002/0 مولار می باشد.
PH برای تمامی محلول ها باید بر روی ۵/۷ تنظیم گردد.
بعد از ساخته شدن محلول ها PH آن ها با دستگاه PHمتر اندازه گیری می شود اگر PH بیشتر از ۵/۷ باشد با بهره گرفتن از HCl 1 نرمال که کم کم به محلول اضافه و PH به ۵/۷ رسانده می شود و اگر PH کمتر از ۵/۷ باشد با بهره گرفتن از KOH 1 نرمال که کم کم به محلول اضافه می شود PH به ۵/۷ رسانده و سپس محلول ها تا موقع مصرف در یخچال نگهداری می شود(Fernandez, et al., 2003).
۲-۲-۳- ساخت محلول تانل[۷۰]
محلول تانل از ترکیب lμ ۵ محلول آنزیم (از ویال آبی رنگ) با lμ۴۵ محلول لیبل (از ویال بنفش رنگ) درون یک ویال حاصل می شود.
۲-۲-۴- ساخت محلول [۷۱] (PBS)
۵۵/۹گرم پودر PBS (یا ۱۰ قرص آن ) در یک لیتر آب مقطر حل می شود(WHO 2010).
۲-۲-۵- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین[۷۲]
۶۷/۰ ائوزین و ۹/۰گرم NaCl را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل و سپس ۱۰ گرم نیگروزین به این محلول اضافه می شود. بعد با بهره گرفتن از کاغذ صافی محلول فیلتر می شود(WHO 2010).
۲-۲-۶- ساخت رنگ رایت[۷۳]
۵/۲ گرم پودر رایت +۲۵۰ سی سی متانول
۵دقیقه میکسر
۲۵۰ سی سی متانول
۵
۵ دقیقه میکسر
۲۵۰ سی سی متانول
۵دقیقه میکسر
۲۵۰ سی سی متانول
۳۰دقیقه میکسر
محلول فیلتر می شود
نکته: در تمام مراحل، محلول نباید نور ببیند.
۲-۳- روشها
۲-۳-۱- روش جمع آوری اسپرم
نمونه های سیمن[۷۴] افراد مراجعه کننده به پژوهشکده علوم تولید مثل یزد ، پس از ۲تا۵ روز خودداری از مقاربت ، از طریق خود انزالی در ظروف استریل با دهانه ی گشاد جمع آوری و سپس برای مایع شدن[۷۵] نمونه ها به مدت ۲۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شدند. ۷۰ نمونه سیمن مورد آنالیز ماکروسکوپی و میکروسکوپی قرار گرفت و ۲۱ نمونه نرمال وارد مطالعه شد.
۲-۳-۲- آنالیز مایع انزالی
۲-۳-۲-۱- آزمایشات ماکروسکوپی: شامل بررسی ظاهر، آبکی بودن، حجم، چسبندگی می باشد.
۲-۳-۲-۱-۱- ظاهر: ظاهر نمونه ها باید خاکستری – شیری رنگ باشد . نمونه هایی که رنگ آنها طبیعی نبودند از مطالعه حذف شدند.
۲-۳-۲-۱-۲- آبکی کردن: حداکثر به مدت ۴۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه حالت مایع و سیال پیدا کند. نمونه هایی که در مدت ۴۵ دقیقه در داخل انکوباتور مایع نمی شدند از مطالعه حذف شدند.
۲-۳-۲-۱-۳- حجم: حجم مایع سیمن از طریق انتقال به لوله های فالکون مدرج اندازه گیری شد نمونه هایی که حجم آنها بالای دو میلی لیتر بود وارد مطالعه شدند.
۲-۳-۲-۱-۴- چسبندگی: اگر موقع قراردادن روی لام کش بیاید، چسبندگی به مقدار کش آمدن بصورت High ،Mild گزارش شد(WHO 2010).
۲-۳-۲-۲- آزمایشات میکروسکوپی
در مطالعات میکروسکوپی سیمن، غلظت، تعداد[۷۶]، تحرک[۷۷]، ناهنجاریهای مورفولوژیکی[۷۸] اسپرم، آگلوتیناسیون[۷۹] اسپرم و در صد زنده بودن[۸۰] اسپرم مطالعه شد. اگر چه اغلب از میکروسکوپ نوری معمولی برای برای مطالعه ی سیمن رنگ نشده استفاده می شود، ولی چنانچه بخواهیم کار دقیق تر باشد می توان از میکروسکوپ فاز کنتراست برای نمونه ی سیمن تازه و رنگ نشده یا نمونه شسته شده استفاده کرد.
ابتدا با سمپلر μl10 نمونه کشیده شده و روی لام قرار می گیرد. بعد روی آن توسط لامل ۲۲×۲۲میلی متری پوشانده می شود. بهتر است قبل از مشاهده ی نمونه، حدود یک دقیقه صبر کرد تا نمونه تثبیت شود. می توان در دمای اتاق این کار را انجام داد، ولی باید دمای اتاق حدود ۲۰تا۲۵ درجه ی سانتی گراد باشد. چنانچه در شان های مختلف تعداد اسپرمی که شمارش می شود با هم خیلی تفاوت داشته باشد نشان دهنده عدم یکنواختی نمونه است. این نمونه ها باید مجدداً مخلوط شود. عدم یکنواخت بودن معرف وجود موکوس، ویسکوزیته غیر طبیعی، محلول شدن غیر طبیعی و آگلوتیناسیون اسپرم می باشد که بایست در گزارش قید شود(WHO 2010).
۲-۳-۲-۲-۱- آگلوتیناسیون
آگلوتیناسیون یعنی چسبندگی اسپرمهای متحرک به یکدیگر که ممکن است این چسبندگی بین اسپرمها در هر ناحیه از اسپرم اتفاق بیفتد. مانند سر به سر، دم به دم یا دم به قطعه میانی و یا ترکیبی از این چسبندگی ها مشاهده می شود. نمونه های دارای آگلوتیناسیون از مطالعه حذف شدند.
شکل ۲-۱- انواع مختلف آگلوتیناسیون:A : چسبندگی سر به سر اسپرم، B: چسبندگی دم به دم، C: چسبندگی دم به قطعه میانی
